expocición grupo N°3

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FALCULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA  DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO

CATEDRA DE:

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

DOCENTE:

LIC. IVÁN PEÑAFIEL

TEMA:

FIJADORES DE TEJIDOS: FIJADORES CON O SIN FORMOL, VELOCIDAD DE PENETRACIÓN, VELOCIDAD DE FIJACIÓN, USO DE ACUERDO AL ESPÉCIMEN, VENTAJAS Y DESVENTAJAS, ACCIÓN EN LOS TEJIDOS Y TIEMPO DE EXPOSICIÓN EN EL PERSONAL DE LABORATORIO DE ANOMIA PATOLÓGICA.

GRUPO N° 3

TERCER SEMESTRE

PERIODO ACADÉMICO: OCTUBRE 2015- FEBRERO 2016

RIOBAMBA – ECUADOR

GRUPO N°-3

INTEGRANTES:

N°-	APELLIDOS Y  NOMBRES
1	Collaguazo Enríquez  Erika Gabriela
2	Molina Ortiz Jhonnatan Paul
3	Valarezo Flores Stefanye Anahí

TEMA:

FIJADORES DE TEJIDOS: FIJADORES CON O SIN FORMOL, VELOCIDAD DE PENETRACIÓN, VELOCIDAD DE FIJACIÓN, USO DE ACUERDO AL ESPÉCIMEN, VENTAJAS Y DESVENTAJAS, ACCIÓN EN LOS TEJIDOS Y TIEMPO DE EXPOSICIÓN EN EL PERSONAL DE LABORATORIO DE ANOMIA PATOLÓGICA.

PARTICIPACIÓN
N°-	25%	50%	75%	100%	Observación	Cal. Docente
1				100%	Trabajo correctamente, y colaboro en todo lo necesario.
2				100%	Colaboro con todas las necesidades requeridas, para la elaboración del presente trabajo
3				100%	Su colaboración fue clave para la correcta elaboración del trabajo.

INTRODUCCIÓN

El Laboratorio de Anatomía Patológica es un área donde se trabaja como mucha precaución y sobre todo sin cometer errores ya que estos conllevarían un resultado que perjudicara al paciente y en si al mismo profesional.

En el área de anatomía patológica se subdivide en fases que son:                                   La fase pre analítica-analítica-post analítica.

Dentro de la fase analítica se encuentra la sub área fijación la cual indicaremos cuales son los tipos de fijadores con o sin formol con sus respectivas características utilizados en distintas muestras de órganos.

Antes de la fijación tisular debemos de obtener la muestra. La extracción de esta constituye la primera parte del estudio histológico; es el Anátomo Patólogo el que se pone en contacto con el órgano que se vaya a estudiar. A ser posible se debe efectuar la extracción tomando un fragmento de la lesión y una toma de los tejidos subyacentes. Su grosor no debe sobrepasar los 5 mm.

La fijación tisular consiste en interrumpir los procesos degradativos que a parecen tras la muerte celular es decir evitar la autolisis, tratando de conservar la morfología y composición de los tejidos lo más próxima a la normalidad. La fijación debe ser inmediata (dentro del minuto que sigue a la extracción del tejido).

La fijación proporciona una imagen estática:

·         Imagen real: es la imagen que tenía el tejido cuando estaba vivo-

·         Imagen equivalente: es el que se obtiene después de la manipulación y comprende la fijación, inclusión, corte y coloración.

Se distinguen dos tipos de fijadores:

·         La fijación inicial o  primaria: realizada de forma inmediata sobre el tejido fresco.

·        La refijacion o fijación secundaria: se realiza con un segundo fijador para algunas estructuras especiales o simplemente para intensificar la fijación inicial.

OBJETIVO GENERAL:

Dar a conocer los tipos de fijadores utilizados en distintos órganos dentro del laboratorio de anatomía patológica 

OBJETIVO ESPECÍFICOS:

Ø  Conocer e identificar las características de los fijadores con o sin formol.

Ø  Identificar las ventajas y desventajas que producen estos fijadores.

Ø  Dar a conocer el uso de los fijadores de acuerdo al espécimen.

Ø  Conocer el tiempo de exposición del personal de anatomía patológica a estos fijadores.

DESARROLLO

La Fijación

Los fijadores además de conservar intacta la estructura durante un espacio de tiempo más o menos largo, paralizan todos los procesos orgánicos.

La fijación ideal se realiza entre 0ºC y 4ºC porque aunque el frío retarda la acción del fijador al contraer la pieza, también paraliza la autolisis del tejido que será más o menos rápida dependiendo por ejemplo los tejidos ricos en enzimas digestivas como el páncreas o aquellos que tienen gran cantidad de gérmenes sufran la autolisis con mayor intensidad.

Las soluciones fijadoras tienen por objeto precipitar las proteínas, aumentar la consistencia de los tejidos, inactivar las enzimas proteolíticas e inhibir el crecimiento bacteriano y por lo tanto, preservar la constitución química y la morfología de los componentes titulares.

Cuando las piezas quirúrgicas son pequeñas o las muestras son obtenidas por aspiración —y de no existir indicaciones de realizar “improntas”, frotis para citología, estudios inmunohistoquímicos o de microscopía electrónica que requieran  fijación especial— se colocarán inmediatamente en formol buferado al 10% en una relación de 10 a 1 fijador/muestra. Para una mejor fijación las piezas no deben exceder de un espesor de 3 mm y un tamaño de 3 x 2 cm

Principios generales de la fijación.

ü  No existe un método universal de fijación, por lo que un agente fijador para un tejido no tiene porque ser adecuado para otro.

ü  No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, porque fijación no equivale a conservación tisular.

ü  Un defecto en la fijación nunca puede ser corregido.

ü  Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con grandes defectos de fijación.

FIJADOR IDEAL CARACTERÍSTICAS:

      Prevenir la autólisis

      Preparar el tejido para el procesado posterior

      Prevenir el daño osmótico

      Preparar al tejido para la “tinción” posterior

      Endurecer el tejido para facilitar su fácil sección

      Prevenir al tejido de retracción y de rotura

      Hacer que los componentes tisulares resistan la extracción por el agua y los solventes orgánicos

      Preservar el tejido en un estado similar al “estado vivo”.

CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA FIJACIÓN.

a) Elección del fijador

 La solución fijadora a utilizar depende del estudio que se quiere realizar. Para las preparaciones de tejidos y órganos, en las que interesan un estudio topográfico de los mismos, deben usarse fijadores con un buen poder de penetración y de difusión. Para estos casos se recomienda utilizar los líquidos de Zenker, Boüin o Helly: En caso contrario se empleará la solución de formol al 10% ó 15% que permite obtener resultados satisfactorios. Líquido considerado como el “fijador universal” pues facilita el empleo posterior de cualquier otro fijador (postfijación) capaz de complementar su acción. se empleará la solución de formol al 10% ó 15% que permite obtener resultados satisfactorios. Líquido considerado como el “fijador universal” pues facilita el empleo posterior de cualquier otro fijador (postfijación) capaz de complementar su acción.

b) Tamaño de las muestras.

 El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se emplean fijadores con escaso poder de penetración y de difusión. c) Volumen del fijador. Una proporción que es necesario emplear será de 1 a 20 (muestra – fijador). Será la más adecuada para garantizar una buena fijación

d) Tiempo de fijación.

 El tiempo en la fijación es importante en dos aspectos.

I.                   El intervalo que media entre la interrupción del aporte sanguíneo y la inmersión de las muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que las muestras se fijen inmediatamente después de obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia se efectúe al poco tiempo de producida la muerte. Mientras más largo es este lapso, los procesos autolíticos que sufran los tejidos serán más evidentes.

II.                 Debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecerán las muestras sumergidas en los fijadores. Este tiempo varía con relación al tipo de fijador que se utiliza; al tamaño y la naturaleza de la muestra y la temperatura de fijación. Por lo tanto los lapsos de fijación varían en rangos muy amplios. En cualquier circunstancia, siempre deben respetarse los tiempos recomendados para cada tipo de fijador para garantizar la conservación de una buena estructura celular y tisular de los tejidos.

 e) Temperatura de la fijación.

 Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas ( 4o C.) dentro de un refrigerador y con la solución fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de fijación pero disminuirá de manera notable la autólisis de los tejidos.

f) Almacenamiento de las muestras.

 En ciertos casos los tejidos fijados no necesitan ser procesados inmediatamente para aplicarles otros pasos de la técnica histológica. Por lo tanto es conveniente almacenar y conservar los tejidos fijados para un uso posterior. Después de eliminar el fijador mediante un “lavado”, se guardan en una solución de alcohol al 70%. Así los tejidos pueden guardarse por un tiempo bastante largo sin que sufran modificaciones morfológicas notorias.

g) Lavado de las muestras fijadas.

 Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtención de secciones delgadas o la coloración correcta de sus componentes celulares.

TIPOS DE FIJADORES

Clases de fijadores según su mecanismo de acción

FÍSICOS

 Congelación: Se utiliza como método para la fijación el enfriamiento por congelación del tejido es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se requiere conservar intacta la estructura antígena del tejido o su contenido enzimático. La clave para una correcta fijación por congelación del tejido es que su realización sea instantánea porque un enfriamiento lento provoca la formación de micro cristales titulares de hielo que pueden agregarse con el paso del tiempo produciendo roturas titulares que dificulten el diagnostico-

El procedimiento idóneo para fijar tejidos por congelación consiste en utilizar ISOPENTANO a menos de 50ºC como agente de congelación y realizar una fragmentación suficiente de la muestra que se vaya a congelar.

Normalmente se preparan bloques de no más de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm de espesor de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera más de 10 segundos. El mantenimiento continuo de isopentano debe realizarse en un congelador programado a -70ºC para que quede compensado la subida inmediata de la temperatura que se produce al extraer el líquido del congelador.

Al enfriar tanto no actúan bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos tejidos utilizamos el micrótomo de congelación o un aparato más evolucionado o criostato el cual tiene como ventajas que la temperatura se mantiene más baja y se pueden realizar cortes más finos entre 2 y 15 micras.

Criodesecación o filiación: Consiste en someter al tejido a dos procesos el primero es la fijación instantánea por congelación en Nitrógeno líquido y el segundo desecación por sublimación directa del agua confiada a vapor en una bomba de vacío es un proceso complicado y costoso pero tiene una ventaja muy importante y es que al eliminar totalmente el agua tisular, paraliza la autolisis y produce una conservación indefinida, además evita que se produzcan enlaces químicos entre el tejido y el fijador, conservando asila estructura antigénica tisular.

Criosustitución: es la sustitución lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un líquido fijador que en ocasiones puede actuar simultáneamente como medio de inclusión. Tras la congelación instantánea del tejido con nitrógeno liquido o isopentano a -50ºC se coloca el tejido congelado en el medio de sustitución, este medio está formado por una mezcla de alcohol etílico, acetona y propilén- glicol. Enfriado a -40ºC, el intercambio del agua tisular por el líquido de sustitución, se realiza dentro de un congelador y debe procurarse que la temperatura no disminuya del punto de congelación del líquido de sustitución.

QUÍMICOS

FIJADORES QUE ACTÚAN POR RETICULARIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

El proceso que denominamos reticularización de las proteínas sobreviene cuando la desnaturalización de éstas moléculas de se produce no por precipitación, sino porque el agente que provoca el fenómeno induce la rotura masiva de los puentes de Hidrógeno determinantes de la estructura helicoidal de las moléculas proteicas, con la formación posterior de una malla reticular polipeptídica por asociación química entre los grupos activos desenmascarados por el líquido fijador.

Entre los principales fijadores tenemos:

Formaldehído o formol: Es gaseoso en estado puro, se vuelve liquido a 21ºC, es tóxico y con un olor característico. Se disuelve fácilmente en agua y en éste estado en concentraciones entre 35-40% y estabilizado con metanol se denomina formalina pura o formol con la acción del frío la formalina pura tiende a precipitar y esta situación suele ser reversible añadiendo unas gotas de NaOH y concentrando la mezcla. Como agente fijador el formaldehído se emplea a una concentración del 4% pero como se parte de una solución de formalina ésta concentración se obtiene diluyendo una parte de ésta de la formalina en 9 de agua en formación salina o tampón.

Ventajas: Es el fijador más barato que existe por lo tanto es de elección para los  trabajos de rutina en Anatomía patológica.

ü  Es un buen fijador único que determina una moderado conversación de la estructura tisular.

ü  Por ser buen desinfectante y no endurecer excesivamente los tejidos, es un medio óptimo para conversar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas.

ü  Provoca escasa retracción tisular

ü  Posee una velocidad de penetración intermedia entre la de los alcoholes y la del sublimado

ü  Tiene aproximadamente una velocidad de un milímetro por hora apenas altera la coloración tisular, por eso es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas.

ü  Es excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general y se emplea como agente de elección para fijar el tejido nervioso y en general antes de cualquier impregnación argéntica.

ü  El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado sin graves inconvenientes modificando la temperatura, así a temperatura ambiente se consigue un fijador completa a partir de las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas. Por este motivo la formalina es un fijador de elección cuando se emplean hornos de microondas en técnicas de histotecnología.

ü  Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan rutinariamente en Anatomía patológica.

Inconvenientes:

ü  Produce abundantes vapores de carácter irritante sobre la conjuntiva y mucosa nasal.

ü  Por acción de la luz y del oxígeno atmosférico se transforma progresivamente en ácido fórmico y ésta sustancia tiene la propiedad de disolver rápidamente la cromatina nuclear por eso con el paso del tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto fantasma para evitar este inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos o emplearse en forma de solución neutra o tamponado.

ü  Posee una relativa capacidad de fijación sobre las proteínas, los pigmentos que contienen hierro y los derivados de la bilirrubina, a éstos últimos les da una coloración verdosa.

ü  Tras la utilización prolongada de formalina debido a que se convierte en ácido fórmico confiere a las piezas un tinte grisáceo y en tejidos que tienen mucha sangre da origen a un pigmento formólico que es negro o pardo oscuro que precipita en aglomeraciones irregulares sobre estructuras preexistentes. Este pigmento se puede eliminar sumergiendo los cortes en alcohol absoluto saturado con acido pícrico compuesta por 10, 12 gramos de pícrico en alcohol etílico al 95-100% durante 5 minutos. O bien podemos sumergirlo en alcohol amonacal que es el de 1 a 5 partes de hidróxido amónico en 95 a 99 de alcohol etílico al 70%. En este caso se tratan los cortes durante 15 minutos, seguidos de dos baños de agua destilada y después otro de alcohol al 70% de 5 minutos de duración cada uno.

Soluciones fijadoras simples que contienen formol: hay 4 tipos:

Formol salino: Se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de disoluciones de formaldehído en agua destilada y se prepara disolviendo 9 gramos de cloruro sódico en 1000 mililitros de formalina al 10%.

Formalina neutra: Se prepara añadiendo a la solución de formalina al 10% una pequeña cantidad de carbonato cálcico insoluble que queda depositado en el fondo del recipiente neutraliza esta sal el exceso de acido fórmico que se produce y aunque puede utilizarse todavía para la formación de tejidos en la práctica ha sido desplazada por las soluciones tamponadas.

Formol tamponado: Es la solución más empleada hoy en día para prevenir el choque osmótico que provoca la disolución de formalina en agua destilada y el depósito de pigmento formólico que ocurre a un pH inferior a 6. Se prepara de la siguiente manera, como amortiguador se emplea el tapón fosfato calibrado con pH de 7.0 a 7.2 de la siguiente fórmula:

ü  FORMALINA PURA…………………………………..100.0 ml.

ü  FOSFATO SÓDICO MONOBÁSICO…………………….4.0 gr.

ü  FOSFATO SÓDICO DIBÁSICO (ANHIDRO**)……..….6.5 gr.

ü  AGUA DESTILADA………………………………...….900.0 gr.

Se emplea fundamentalmente para fijar tejidos nerviosos en la preparación de algunas técnicas de impregnación argéntica. Y se prepara añadiendo una parte de ácido acético glacial a 9 partes de formalina al 10% con ello se consigue un pH en torno a 2.

* 4gr: no tiene agua, cogemos 3.5gramos si no pone nada en el bote cogemos 4 gramos.

Formol cálcico o solución de Baker: Se emplea como fijador de elección en algunas técnicas de histoenzimología y se prepara añadiendo cloruro cálcico al 1% a una solución de formalina neutra o tamponada al 10%

LÍQUIDOS FIJADORES SIMPLES

Dependiendo del mecanismo de actuación sobre los tejidos podemos clasificar los líquidos fijos simples en 4 apartados:

 Fijadores por deshidratación tisular: Alcohol etílico y acetona. Son sustancias altamente higroscópicas es decir absorben agua actúan eliminando tanto el agua libre como el agua ligada a las proteínas de forma que estas últimas precipitan y disminuyen su solubilidad. Este cambio proteico es conocido con el nombre de desnaturalización y provoca importantes alteraciones en la organización y estructura celular y tisular, por tanto estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la morfología orgánica sobre todo si se emplean como agentes fijadores aislados. Alguno de ellos como por ejemplo la acetona, altera poco la estructura antigénica tisular y ello se debe a que estos fenomenitos inducidos son reversibles en parte tras la rehidratación. El fundamento molecular de la acción deshidratante de los alcoholes y la acetona, está en la competición que establecen con las proteínas por las moléculas de agua cuando se encuentra en soluciones concentrada, los principales agentes fijadores por deshidratación son alcoholes metílico y etílico, acetona y cloroformo.

Los únicos que se utilizan como fijadores simples son el alcohol etílico y la acetona.

El alcohol metílico se emplea exclusivamente para la fijación de extensiones hematológicas.

Alcohol etílico: líquido claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor agradable. En el comercio se puede encontrar puro en cuyo caso tiene fuertes gravámenes tributarios para evitar su utilización clandestina para evitar la fabricación de bebidas alcohólicas, o bien lo tenemos desnaturalizado diluido al 90 o 70 %. Como fijador único utilizaremos alcohol a unas concentraciones entre el 70 y 90% y se obtiene cogiendo de 70-90 ml de alcohol puro y se lleva hasta 100 con agua destilada. La fijación mas potente va a corresponder a las soluciones más concentradas pero a altas concentraciones la capa externa del tejido se endurece en exceso, lo que impide la penetración del fijador a la parte interna de la pieza.

El tiempo de fijación correspondiente a una pieza de 5mm de espesor es dos a cuatro horas renovando unas 3 veces el líquido.

Es un fijador que preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas titulares, fija los pigmentos y se emplea en las extensiones citológicas. Como altera escasamente la estructura antigénica de los tejidos es un buen agente fijador para inmuno histoquímica.

Entre las ventajas del alcohol están:

ü  Fijan y deshidratan al mismo tiempo

ü  Posee una gran velocidad de penetración

ü  Precipita muy rápidamente las proteínas y el glucógeno lo que unido a la anterior propiedad aporta extraordinariamente el tiempo de fijación es un notable agente bactericida y por tanto un buen conservante.

Entre sus inconvenientes tenemos los siguientes:

ü  Fijan y deshidratan al mismo tiempo: es incompatible con muchos fijadores: KCr2 o el OsO3 lo que limita su participación en muchas mezclas fijadoras.

ü  No fija adecuadamente la cromatina porque disuelve los ácidos nucleídos y además disuelve parcialmente los lípidos.

ü  Endurece y contrae excesivamente los tejidos.

ü  A medida que realiza la fijación se va diluyendo al incorporar el agua que extrae de los tejidos por lo cual pierde actividad progresivamente

ü  Prepara mas la tinción porque carece de efecto mordiente

ü  Puede dar origen a fenómenos de desplazamiento de sustancias.

Acetona: es un líquido transparente, inflamable, muy volátil y de olor dulzor. Des hidrata rápidamente y considerable el tejido por lo que es poco utilizable. El tiempo de fijación nunca excederá de dos horas y en piezas delgadas son recomendables 20 minutos. Su uso como fijador está prácticamente limitado a los métodos  e inmuno histoquímicos porque conserva muy bien la estructura antigénica y la actividad enzimática, a veces también se utiliza en microscopia electrónica para la fijación del material que se va a incluir en resinas acrílicas. Se emplea generalmente sin diluir a 4ºC, entre sus inconvenientes mas notables provocan una gran contracción tisular y por tanto grandes artefactos que suelen hacer inútil su empleo en el microscopio óptico convencional otro de sus inconvenientes es que debido a su rapidez de acción y a su capacidad de endurecimiento es imprescindible controlar el tiempo de fijación.

Todos los fijadores de este grupo son de carácter ácido y se emplean formando parte de mezclas fijadores. Poseen además una gran velocidad d penetración en los tejidos y algún poder de descalificación.

Ácido acético: Líquido transparente y fuerte olor avinagrado. Sus vapores son muy inflamables en estado puro se denomina: ác. Acético glacial. Cuando la temperatura ambiente disminuye o aumenta, disminuye por debajo de los 10ºC tiende a solidificarse en forma de agujas cristalizadas muy cáusticas. Se utiliza diluido en concentraciones entre el 1 y 5 % formando parte de mezclas fijadores o de soluciones decalcificantes. Entre las ventajas que tiene es el fijador ideal para núcleo proteínas y acido nucleicos y otra es precipitar proteínas sin sustraer el agua de los tejidos porque no es giroscópico y produce cierto edema intersticial que compensa la excesiva refracción pausado por otros agentes fijadores. Entre los inconvenientes es mal fijador de citoplasma y membranas celular y destruye mitocondrias.

Ácido tricloroacético: Son cristales incoloros cáusticos, solubles en agua en solución al 5 % fija los nervios de 8 a 20 horas. Nunca se lavan el tejido después de usar éste ácido porque el edema que produce es excesivo y de lugar a muchos artefactos. Al 2.5 % se usa mezclado con otras sustancias.

Ácido sulfosalicílico: Se usa al 5% es buen fijador porque permite casi todas las coloraciones endurece óptimamente los tejidos pero no los contrae después hay que lavar el tejido con agua pero la fijación debe hacerse en la oscuridad de 6 a 24 horas.

Ácido crómico: Se emplea en disoluciones al 2% formando parte de mezclas fijadoras, se utiliza bastante en microscopia electrónica.

 Entre las ventajas que tiene:

ü  Excelente fijador estructural y actúa como mordiente en tinciones que emplean colorantes básicos, entre los colorantes que tiene es que incompatible con fijadores habituales como el formol y alcohol.

ü  Escasa velocidad de penetración en trozos pequeños tarde varios días en penetrar en la pieza

ü  Impregna de coloración verdosa los tejidos por lo que hay que lavarlos abundantemente en agua destilada tras el uso de ese acido, los tejidos quedan excesivamente blandos.

FIJADORES POR FORMACIÓN DE SALES CON LOS TEJIDOS

 En estos casos el fijador es un catión metálico fundamentalmente cromo o mercurio o un derivado orgánico como el ácido pícrico que son susceptibles de formar con los tejidos sales denominados protenatos metálicos o picratos por lo general todos los agentes d este grupo poseen gran velocidad de penetración y fijación porque la formación de la sal, se produce instantáneamente.

Cloruro de mercurio o sublimado: es un polvo cristalino blanco y venenoso y hay que usarlo bajo campana se usa en soluciones del 5-6%. El efecto fijador se consigue por la combinación de los iones de Mercurio con los grupos ácidos de las proteínas especialmente con los de carácter carboxílico, hidroxílico, sulfidrilo y con los residuos fosfóricos de las nucleoproteínas.

Entre sus ventajas tenemos:

ü  Es un excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares por lo que es el de elección para patologías hematopoyéticas y renales, donde el diagnostico se apoya normalmente en la observación de finos detallesnucleares y citoplasmáticos.

ü  Es un excelente mordiente por lo que produce intensa y brillante coloración nuclear y citoplasmática.

Inconvenientes:

ü  No es un buen bactericida por lo que no es un buen líquido conservante tiene escasa capacidad de penetración por lo que requiere fraccionamiento cuidadoso del tejido.

ü  Si se prolonga demasiado tiempo de actuación contrae y endurece los tejidos hasta dificultar el corte en el micrótomo, por eso nunca deben sobrepasarse las 4 horas de fijación. Tras haber cumplido esta y común paso previo a la inclusión, los tejidos pueden conservarse indefinidamente en alcohol etílico al 70%.

Dicromato Potásico: es un polvo amarillento que reacciona con las proteínas para formar cromatos, se utiliza en disolución acuosa al 1-2%, fija las proteínas por lo que las mitocondrias quedan perfectamente conversadas y da un aspecto homogéneo al núcleo después de la fijación del dicromato deben lavarse abundantemente con agua.

Ventajas:

Es que tiene un fuerte efecto mordiente excelente fijador para lapidar complejos para mielina, mitocondrias y aparato de Golgi que los contienen en abundancia. Su utilización es indispensable para técnicas de impregnación argéntica de las células del sistema nervioso central.

Inconvenientes:

ü  El primero de ellos es incompatible con alcohol y formol, posee baja velocidad de penetración y endurece escasamente los tejidos lo que puede dificultar el corte en el microtomo.

ü  Los tejidos han de ser lavados después de fijados en una solución salina o tamponada para evitar el depósito de pigmento verde que puede producirse en el curso de la inclusión o coloración posterior.

Ácido Pícrico: En el comercio se encuentra en forma de agujas cristalizadas de color amarillo muy tóxicas de carácter explosivo.

Actúa coagulando las proteínas a través de la formación de picratos que las confieren gran apetencia por colorantes ácidos. Se utiliza en solución saturada al 2%, es un excelente fijador estructural que conserva adecuadamente la composición proteica de los tejidos. Controlando adecuadamente el tiempo de fijación produce una óptima contracción de los tejidos que favorece su procesamiento histológico.

Aunque tiene penetración algo lenta posee buena velocidad de fijación no disuelve el glicógeno ni los lípidos es el fijador de elección para estas sustancias.

Posee una leve acción decalcificante por lo cual puede emplearse como fijador par a las muestras de tejido óseo.

Inconvenientes:

ü  En estado puro el ácido pícrico es explosivo si se somete a color hay que mantenerlo alejado de fuentes de color.

ü  Deben dejarse evaporar sus disoluciones para evitar la formación de precipitados. Si se prolonga el efecto de fijación que es de 4-18 horas dependiendo de tamaño pieza aparecen inconvenientes por una excesiva retracción tisular. Sobre todo si la pieza ha sido inadecuadamente lavado en agua y luego deshidratada.

ü  Tiñe los tejidos de color amarillo y si no se elimina completamente antes de la inclusión en parafina provoca un continuo deterioro de la estructura tisular que pueda hacer imposible su estudio histopatológico algunas semanas después del procesamiento.

ü  La eliminación se realiza mediante lavados sucesivos en alcohol etílico al 70-80% o en una solución saturada de LiCO4 en alcohol de 70 es incompatible en la inclusión en celoidina.

Acetato de uranilo: Es una sal soluble en agua, cristalizado de color amarillo, se descompone con la luz, no endurece los tejidos, se usa en soluciones al 2-3% normalmente mezclado con OsO3 y después de la fijación hay que lavar el tejido abundantemente con agua.

MEZCLAS FIJADORAS

Tenemos dos tipos:

Glutaraldehido: líquido oleoso en comercios se encuentra en disolución al 25%. Mecanismo de actuación es el mismo que el formaldehído y como fijador se emplea en concentraciones entre el 1 y el 3%.

Ventajas:

Es el primer fijador de elección para microscopía electrónica porque tienen una excepcional capacidad para preservar la morfología celular.

Se emplea para fijación de animales por perfusión en patología experimental.

Inconvenientes:

ü  Tiene velocidad de penetración muy baja por lo que los fragmentos de tejido no pueden tener volumen superior a unos pocos milímetros cúbicos.

ü  Posee gran capacidad de retracción y endurecimiento tisular que impide prolongar el tiempo de fijación por encima de las 3 horas.

ü  Tiene osmolaridad muy baja por lo que hay que emplearlo disuelta en soluciones amortiguadoras.

Tetraóxido de Osmio: OsO4: En el comercio se encuentra en forma de cristales amarillentos solubles en agua, muy volátiles y tóxicas. Actúa igual que el formol y se prepara como agente fijador al 1% en tampón fosfato.

Ventajas:

Es el mejor fijador estructural conocido, por eso se utiliza en microscopía electrónica específicamente como 2º fijador.

Inconvenientes

ü  Muy caro y descompone en preseca de luz por lo que hay que conservarlo en recipientes opacos y oscuridad.

ü  Aunque sea soluble en agua es difícil preparar disoluciones acuosas con las que se trabaja

ü  Muy tóxico y en estado cristalino emite vapores que irritan la córnea mucosa respiratoria. Su manipulación es obligatoria en una campana de extracción de gases para prevenir la aparición de queratitis.

ü  Posee muy baja capacidad de penetración tisular por lo que las muestras deben tener muy poco volumen.

ü  Es incompatible con formol y dificulta la coloración nuclear, esto obliga a lavar abundantemente los tejidos tras utilizarlo.

La combinación de diversos fijadores simples formando soluciones, complejas llamadas mezclas fijadoras pretende sumar las ventajas de cada una de ellas amortiguando sus inconvenientes. Desde un punto de vista general se clasifican en dos grupos:

AQUELLAS QUE CONTIENEN FORMOL

Liquido de Bouin: Solución muy usada como alternativo a la formalina cuando queremos fijar ciertos Tejidos como piel órganos endocrinos, testículos y tejido embrionario en general. Sin embargo no está fijado para la fijación de biopsias renales sobre los cuales provoca una severa distorsión.

Se prepara de la siguiente manera:

SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁC. PÍCRICO

ü  (ÁC. PÍCRICO AL 1-2% EN AGUA DESTILADA)……..750.0 ml.

ü  FORMALINA CONCENTRADA………………………250.0 ml.

ü  ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………….50.0 ml.

ü  PH. FINAL…………………………………………………2.2

ü  TIEMPO DE FIJACIÓN……………………………..2 a 24 horas

§  Fijador de Bouin-Hollander: es una variante del líquido de Bouin especialmente indicado para la fijación de los cilindros de biopsia de médula ósea cuando no es posible controlar el tiempo de fijación de la muestra en éste líquido, la conservación, puede incluso conservar las 48 horas sin que se produzca excesivo endurecimiento.

Se prepara de la siguiente manera:

§  ACETATO NEUTRO DE COBRE………….……………2.5 gr.

§  ÁC. PÍCRICO……………………………………………..4.0 gr.

§  FORMALINA CONCENTRADA……………………....10.0 ml.

§  ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………….……….1.5 ml.

§  AGUA DESTILADA…………………………………..100.0 ml.

Para preparar la solución se disuelve primero la sal de cobre en el agua destilada luego se añade el ácido pícrico y tras filtrarlos el formol y el ácido acético glacial.

Esta solución se conserva indefinidamente a temperatura ambiente el tiempo de fijación oscila entre 48-72 horas y sigue las mismas precauciones que el líquido de Bouin

Bouin alcohólico (fijador de Dubosq-Brasil): Es una alternativa de líquido de Bouin cuando la pieza que se debe fijar es relativamente voluminosa porque posee una velocidad de penetración mucho más elevada. Se utiliza también cuando se precisa una fijación específica de sustancias hidrosolubles como el glucógeno ya que evita su disolución.

Se prepara de la siguiente manera:

ü  ALCOHOL ETILICO 80%...............................................75.0 ml.

ü  ÁC. PÍCRICO………………………………………………0.5 gr.

ü  FORMALINA CONCENTRADA………………...……..30.0 ml.

ü  ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………..….7.5 ml.

Mezclar antes de usar el tiempo medio de fijación para fragmentos con un espesor en torno a 5 milímetros es de 2 a 3 horas.

Liquido de Gendre: Es una variación que está especialmente diseñada para la fijación del glucógeno y pigmentos derivados de la hemoglobina. Se prepara por:

ü  SOLUCIÓN SATRUADA DE ÁC. PÍCRICO

ü  EN ALCOHOL ETÍLICO AL 70%.....................................80.0 ml.

ü  FORMALINA CONCENTRADA………………………...15.0 ml.

ü  ÁC. ACÉTICO GLACIAL………………………………….7.5 ml.

El tiempo de fijación oscila entre 1 y 4 horas. Tras acabar el proceso debe realizarse sucesivamente 2 lavados cortos en etanol al 80, 95 y 100º

Fijador de Müller: Es la disolución acuosa de un fijador simple de dicromato potásico con la adición de sulfato sódico su importancia actual radica en que se emplea para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Lo que llamamos solución madre. Está compuesta de:

ü  DICROMATO POTASICO…………………………………2.5gr.

ü  SULFATO SÓDICO………………………………………..1.0 gr.

ü  AGUA DESTILADA ……………………………………100.0 ml.

Tiempo de fijación 4 y 8 horas. Tras la fijación es necesario lavar abundantemente en agua corriente durante unas horas.

Fijador de Orth: Hoy día se emplea exclusivamente en ciertas técnicas de fijación de tejido nervios. Se prepara de la siguiente manera:

ü  Solución stock de Orth: idéntica a la composición del fijador de Müller.

ü  Solución de trabajo: en el momento de su uso se mezclan:

ü  SOLUCIÓN STOCK………………………………..90.0 ml.

ü  FORMULINA CONCENTRADA………………….10.0 ml.

El tiempo de fijación de tejido nervioso es de 48 horas y tras el proceso de fijación los tejidos han de ser lavados abundantemente en agua y almacenados en alcohol etílico al 70%

Solución de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly): Ambas mezclas son en esencia casi idénticas. La denominación B5 corresponde en realidad a una modificación de la de Zenker.

La solución de Zenker-formol contiene dicromato potásico y sulfato sódico. La mayor utilidad de estos fijadores es que mejoran considerablemente la tinción nuclear, de hecho la fijación en una mezcla que contenga sublimado es hoy día prácticamente imprescindible para el diagnóstico morfológico en las patologías del sistema linfoide y hematopoyético. Además estas soluciones B5 zenker formol son los fijadores de elección para el riñón, hígado, fibras de tejido conectivo y para fibrina.

Se prefiere la solución de B5 porque al no contener dicromato, esto permite una mejor conservación de la cromatina nuclear y de la estructura antigénica tisular.

Solución de 35:

*Solución stock de B5: Esta mezcla es estable durante bastante tiempo pero concentrado en frasco opaco y oscuridad.

ü  CLORURO MERCÚRICO...………………………………… 12.0 gr.

ü  ACETATO SÓDICO...………………………………………….2.5 gr.

ü  AGUA DESTILADA C.S.P…………………………………….200 ml.

Solución de trabajo de B5: Esta solución es inestable debido a que el formaldehído reduce el sublimado a cloruro mercurioso y mercurio metálico que se depositan en forma de un precipitado blanco grisáceo, por este motivo y por el elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado, el tiempo de fijación no debe superar las 4 horas. Además el espesor máximo de las muestras no debe superar los 4 mm debido al escaso poder de penetración de la mezcla fijadora. Debido a la aparición de precipitados mercúricos sobre los tejidos las secciones histológicas antes de ser coloreados. Han de ser sometidas a un tratamiento específico mediante soluciones que eliminan estos depósitos. Tras la fijación los tejidos se pueden conservar indefinidamente en alcohol etílico al 70-80%

ü  SOLUCIÓN STOCK DE B5…………………………………20.0 ml.

ü  FORMALINA CONCENTRADA ………………………….…2.0 ml.

Solución de Zenker-Formol Eliminación del pigmento mercúrico:

*Solución stock de Zenker:

ü  CLORURO MERCÚRICO………………………………………5gr.

ü  DICROMATO POTÁSICO……………………………….…..2.5 gr.

ü  -SULFATO SÓDICO ……………………………………………1 gr.

ü  AGUA DESTILADA C.S.P. ……………………..………..100.0 ml.

* Solución de trabajo: en el momento de su uso mezclamos:

ü  SOLUCIÓN STOCK DE ZENKER…………………………..95 ml.

ü  FORMALINA CONCENTRADA……………………………...5 ml.

Tanto para la solución almacenada como para la de trabajo deben guardarse las mismas precauciones que para la de B5

Eliminación del pigmento mercúrico o deszenkerización:

Se realiza tratando las secciones histológicas antes de su coloración con soluciones yodadas y utilizamos:

*Solución de LUGOL:

ü  YODURO POTÁSICO…………………………………………..2gr.

ü  CRISTALES DE YODO ………………………………………..1gr.

ü  ALCOHOL ETÍLICO 70-80%................................................100 ml.

*Solución de tiosulfato sódico:

ü  TIOSULFATO SÓDICO………………………………………..5gr.

ü  AGUA DESTILADA………………………………………...100ml.

Después de la desparafinación hay que tratar los cortes durante diez minutos con la solución yodada a continuación lavar bien en agua destilada después decolorar durante dos minutos en la solución en agua corriente durante 10 minutos antes de realizar la coloración.

AQUELLAS QUE NO CONTIENEN FORMOL

Líquido de Zenker: Trata de combinar los efectos favorables del sublimado y del dicromato potásico. En la práctica habitual ha sido sustituido por B5. Su empleo ha quedado prácticamente restringido al proceso de refinación-decalcificación a que son sometidas las biopsias de médula ósea cuando se realiza una fijación inicial con B5.

 Se prepara de la siguiente manera.

ü  SOLUCIÓN STOCK DE ZENKER………………………………95.0 ml.

ü  ÁC. ACÉTICO GLACIAL……………………………………..… 5.0 ml.

El ácido acético reacciona con el dicromato y hace que la solución se oscurezca progresivamente, por lo que debe recomponerse antes de su uso.

El tiempo de fijación puede ser más prolongada que con la solución de b5 porque el ácido acético que contiene, produce un excesivo endurecimiento. Pero no se deben sobrepasar las 48 horas. Tras la fijación el material debe ser tratado con sulfato sódico al 5% durante 1-2 horas.

Liquido de Carnoy: Es el mejor fijador conocido para el glucógeno y en general, para los hidratos de carbono simples y para proteínas fibrilares y sobre todo miofibrillas, su acción fijadora es extremadamente rápida deshidratando el tejido al mismo tiempo, sin embargo produce una excesiva retracción mística y una hemólisis masiva de eritrocitos así como una pobre conservación estructural del ADN. Está compuesta por:

ü  ETANOL ABOSLUTO…………………………………………..60.0 ml.

ü  CLOROFORMO………………………………………………….30.0 ml.

ü  ÁC. ACÉTICO GLACIAL………………………………………..10.0 ml.

El tiempo de fijación puede ser acortado hasta 3 horas. Las muestras deben cambiarse directamente a alcohol etílico absoluto. El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado la deshidratación en alcohol, para prevenirlo se puede sustituir el etanol por metanol en la composición de líquido fijador, que además provoca menor retracción tisular, y para conservar la pieza se deposita en alcohol etílico absoluto.

Lavado postfijación.

Es el aclarado que se realiza después del proceso de fijación para eliminar los residuos del agente fijador, con el fin de limitar el tiempo de contacto entre el fijador y el tejido o impedir el contacto del fijador con los medios de inclusión utilizados, para proseguir el tratamiento de la muestra, a veces algunos colorantes alteran su efecto si la pieza contiene restos de determinados fijadores, como es el caso por ejemplo del ácido pícrico. No todos los fijadores deben lavarse igual:

ü  Las piezas fijadoras en formalina se lavan con agua prolongadamente.

ü  Fijadas por ácido pícrico hay que introducir las piezas hasta quitar color amarillo.

ü  Fijadas por tricloroacético hay que introducirlas en alcohol de 90%.

Conservación de tejidos.

Cuando se practica un estudio histológico, solo se incluyen una pequeña porción del material remitido para el análisis. El resto se guarda de reserva para estudios complementarios. Casi nunca es posible conservar el tejido en el mismo líquido utilizado para la fijación.

La solución conservante más indicada en la mayor parte de los casos es el alcohol etílico al 70% en él además de iniciarse la deshidratación, el tejido una vez fijado puede conservarse durante meses sin apenas sufrir cambios, como alternativa más simple y siempre que no se desee preservar el tejido para posteriores estudios inmunohistoquímicos, pueden usarse como conservante una solución de formalina neutra o tamponada al 10%.

Cuando lo que se produce exclusivamente es derramar la intrusión del tejido en parafina sobre todo para pequeñas muestras delicadas se puede realizar la deshidratación completa en alcoholes crecientes y conservarlos en butanol que permite una conservación indefinida y mejora la textura tisular.

Cuando se deseen conservar órganos completos procedentes de necropsias podemos utilizar las soluciones de JORES.

JORES I:

ü  SULFATO SÓDICO……………………………………………………….22 gr.

ü  SULFATO POTÁSICO……………………………………………………..1 gr.

ü  CLORURO SÓDICO………………………………………………………..9 gr.

ü  BICARBONATO SÓDICO…………………………………………….….18 gr.

ü  FORMOL 10%.............................................................................................50 ml.

ü  SOLUCION ACUOSA SATURADA DE HIDRATO DE CLORAL…….50 ml.

ü  AGUA DESTILADA C.S.P.……………………………………………1000 ml.

JORES II:

ü  ACETATO POTÁSICO…………………………………………………300 gr.

ü  GLICERINA…………………………………………………………….600 ml.

ü  AGUA DESTILADA C.S.P. ………………………………………..1000 ml.

En recipiente bien cerrado se conserva hasta años.

Resultados de la fijación y su interpretación.

Durante la fijación se producen procesos que modifican la estructura tisular; se producen desgarros en tejidos que siendo de distinta estructura están en contacto, por ejemplo la muscular y la submucosa y al exponerlos a cambios bruscos, como tienen distintos contenidos, en agua se contraen más que otros. También se producen grietas por la misma causa que los desgarros, pero son pequeñas aberturas que pueden dar lugar a error porque parecen naturales, son muy difíciles de evitar y son más frecuentes cuando la fijación se hace en tejidos que ya han comenzado su descomposición.

Estas deformaciones de los tejidos que no corresponden con la realidad y son producidas por la agresividad de los fijadores se denominan artefactos y varían de un fijador a otro debido a las características propias de cada uno.

CONCLUSIONES

·         Se determinó que el correcto conocimiento de los fijadores con o sin formol ayudara a un procedimiento de fijación en distintas muestras de órganos.

·         El conocer las ventajas y desventajas que producen estos fijadores ayudara a tener las debidas precauciones al momento de utilizados en muestras.

·         El conocimiento adecuado de la composición de los fijadores ayudara a identificar la capacidad de fijación de estos en distintas muestras.

·         Se concluyó que se debe tener en cuenta el tiempo de exposición del personal del Laboratorio de Anatomía Patológica ante los fijadores ya que son tóxicos y esto puede ser perjudicial para la salud del personal que labora en esta área.

RECOMENDACIONES

·         Debe tenerse en cuenta el tiempo específico de fijación de acuerdo al fijador que estemos usando, para evitar se dañe la muestra.

·         El líquido fijador debe ser colocado con rapidez en la muestra.

·         Deberá elegirse el fijador más conveniente de acuerdo a la muestra que tengamos.

·         Es recomendable efectuar la fijación a bajas temperaturas.

·         Después de terminado el proceso de fijación, se deberá lavar la muestra, evitando así que los tejidos se endurezcan.

BIBLIOGRAFÍA

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